Plásmido CRISPR de Activación (m) PHT2: sc-425761-ACT

El gen murino *Slc15a3* codifica el transportador de histidina y oligopéptidos acoplado a protones PHT2 (SLC15A3), un transportador de membrana endolisosomal que favorece el flujo de péptidos e histidina en compartimentos intracelulares ácidos. Al regular la disponibilidad de sustratos y el transporte dependiente del pH luminal, PHT2 contribuye al metabolismo asociado a los lisosomas y al manejo de péptidos, lo que puede influir en el procesamiento de antígenos y en redes de señalización de la inmunidad innata. La expresión de *Slc15a3* está enriquecida en linajes mieloides y suele asociarse a la estimulación inflamatoria, situándolo en vías que se solapan con la defensa del huésped y con programas transcripcionales sensibles al estrés. La alteración del transporte lisosomal y la activación inmunitaria son relevantes en modelos de inflamación crónica y daño tisular mediado por el sistema inmunitario, por lo que *Slc15a3* constituye un nodo útil para estudios mecanísticos.

PHT2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Slc15a3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PHT2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Slc15a3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Slc15a3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PHT2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Slc15a3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PHT2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PHT2 en células tumorales con expresión de Slc15a3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.