Plasmide CRISPR d'Activation (h) Peroxin 13: sc-404060-ACT

PEX13 code la péroxine 13, un composant intégral de la membrane peroxysomale indispensable à la biogenèse des peroxysomes et à l’import des protéines matricielles. La péroxine 13 agit au sein de la machinerie de translocation des protéines peroxysomales en coordonnant des péroxines qui reconnaissent les récepteurs de cargaison PTS1/PTS2, ce qui soutient l’import d’enzymes nécessaires à la β‑oxydation des acides gras et au métabolisme des espèces réactives de l’oxygène. L’altération de PEX13 perturbe l’homéostasie peroxysomale, modifie la gestion des lipides et l’équilibre redox, et est associée à des phénotypes de troubles de la biogenèse des peroxysomes liés à un défaut d’assemblage de l’organite. PEX13 humain constitue donc une cible utile pour étudier, dans des modèles cellulaires, la dynamique de l’import peroxysomal, la reprogrammation métabolique et la signalisation du stress des organites.

Peroxin 13 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PEX13 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Peroxin 13 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PEX13 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PEX13, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Peroxin 13. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PEX13 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Peroxin 13 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Peroxin 13 dans les cellules tumorales présentant une expression de PEX13 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.