Pericentrin 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403161-ACT

NUP85 kodiert eine zentrale Komponente des Nup107–160-Subkomplexes des Kernporenkomplexes (NPC), unterstützt den nukleozytoplasmatischen Transport und erhält über den gesamten Zellzyklus hinweg die Architektur der Kernhülle. Über seine Funktionen bei der NPC-Assemblierung, der Mitoseprogression und der Genomstabilität beeinflusst NUP85 Transkriptionsprogramme, indem es den nuklearen Import und Export von Signalmolekülen und Zellzyklusfaktoren reguliert. Störungen von Kernporen-Komponenten wurden in verschiedenen Krankheitskontexten mit Defekten in der RNA-Prozessierung, Stressantworten und aberranter Proliferation in Verbindung gebracht, wodurch NUP85 einen nützlichen Einstiegspunkt für die Untersuchung transportgekoppelter Regulation der Zellphysiologie darstellt. In humanen Zellmodellen lassen sich Auswirkungen einer veränderten NUP85-Aktivität auf den nuklearen Transport, die Checkpoint-Kontrolle und nachgeschaltete Veränderungen von Signalwegen untersuchen.

Pericentrin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NUP85-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pericentrin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NUP85-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NUP85-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pericentrin 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NUP85-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pericentrin 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pericentrin 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NUP85-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.