PDX-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400792-ACT

PDX1 kodiert PDX-1, einen Homeobox-Transkriptionsfaktor, der die Pankreasentwicklung steuert und die Identität reifer β-Zellen aufrechterhält, indem er die Transkription des Insulin-Gens sowie endokrine Differenzierungsprogramme reguliert. In menschlichen Zellen integriert PDX-1 nährstoffabhängige und wachstumsfaktorvermittelte Signalwege mit transkriptionellen Netzwerken, die Glukoseerkennung, Sekretionskapazität und zelluläre Stressantworten kontrollieren. Eine fehlregulierte PDX-1-Aktivität ist mit beeinträchtigter β-Zell-Funktion und veränderter Spezifizierung pankreatischer Zelllinien verbunden, was PDX-1 für Studien zu diabetesbezogenen Mechanismen und zur Entwicklungsbiologie des Pankreas relevant macht. Als Masterregulator wird PDX-1 häufig genutzt, um die transkriptionelle Schaltkreise zu untersuchen, die endokrine Schicksalsentscheidungen und die metabolische Homöostase steuern.

PDX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDX1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDX1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDX1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDX-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDX1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDX-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDX-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDX1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.