Plasmide CRISPR d'Activation (h) PDLIM5: sc-405340-ACT

PDLIM5 code une protéine d’échafaudage contenant des domaines PDZ et LIM, qui se localise aux structures associées à l’actine et relie l’organisation du cytosquelette à la transduction du signal. Dans les cellules humaines, PDLIM5 participe à la régulation de la dynamique de l’actine, de l’adhérence cellulaire et des voies mécanosensibles en coordonnant des interactions protéine–protéine au niveau des fibres de stress et d’assemblages de type disque Z. Par ces fonctions, elle influence des processus tels que la morphologie cellulaire, la migration et la contractilité, et s’interface avec des réseaux de signalisation impliquant des kinases qui répondent aux signaux du cytosquelette. Des altérations de l’expression de PDLIM5 et de l’activité des voies associées ont été étudiées dans le contexte de la biologie des maladies cardiovasculaires et neuropsychiatriques, ce qui étaye son intérêt comme nœud d’étude des mécanismes de signalisation couplés au cytosquelette.

PDLIM5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PDLIM5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PDLIM5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PDLIM5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PDLIM5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PDLIM5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PDLIM5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PDLIM5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PDLIM5 dans les cellules tumorales présentant une expression de PDLIM5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.