PDH-E1α CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401044-ACT

PDHA1 kodiert die E1‑Alpha‑Untereinheit des Pyruvatdehydrogenase(PDH)-Komplexes, eines mitochondrialen Multienzym-Komplexes, der die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl‑CoA katalysiert und damit die Glykolyse mit dem Tricarbonsäurezyklus und der oxidativen Phosphorylierung verknüpft. Die Funktion von PDH‑E1α wird streng durch eine phosphorylierungsabhängige Kontrolle der PDH‑Aktivität reguliert und koordiniert in Abhängigkeit von der Nährstoffverfügbarkeit den Kohlenstofffluss, das Redoxgleichgewicht und die ATP‑Produktion. Eine veränderte PDHA1‑Expression oder eine Fehlfunktion des PDH‑Komplexes ist mit metabolischer Reprogrammierung, beeinträchtigter mitochondrialer Atmung und Phänotypen der Laktatazidose assoziiert, was für die neurometabolische und mitochondriale Krankheitsforschung relevant ist. Als zentraler Knotenpunkt im Kohlenstoff‑Zentralstoffwechsel wird PDHA1 häufig in Modellen zu oxidativem Stress, Hypoxieantwort und bioenergetischer Anpassung untersucht.

PDH-E1α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDHA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDH-E1α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDHA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDHA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDH-E1α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDHA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDH-E1α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDH-E1α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDHA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.