Plásmido CRISPR de Activación (m) PDE4D: sc-433646-ACT

El gen **Pde4d** de ratón codifica la fosfodiesterasa 4D (PDE4D), una fosfodiesterasa específica de AMPc que hidroliza el AMPc a 5′-AMP y modula la amplitud y el confinamiento espacial de la señalización dependiente de PKA y EPAC. Al regular el tono intracelular de los segundos mensajeros, PDE4D influye en las respuestas impulsadas por GPCR, en programas transcripcionales como la señalización de CREB y en procesos que incluyen la proliferación celular, la diferenciación y la modulación inmunitaria. La actividad de PDE4D se integra con la señalización compartimentalizada a través de proteínas de anclaje de la proteína quinasa A (AKAP) y puede afectar la dinámica de la vía MAPK/ERK mediante la comunicación cruzada con efectores del AMPc. La desregulación del recambio de AMPc mediado por PDE4D se ha implicado en la inflamación y en fenotipos neurobiológicos, lo que respalda su uso como un nodo mecanístico en estudios de señalización relevantes para enfermedades en modelos murinos.

PDE4D El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Pde4d sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PDE4D El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Pde4d en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Pde4d, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PDE4D. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Pde4d y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PDE4D en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PDE4D en células tumorales con expresión de Pde4d silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.