patched 2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404866-ACT

PTCH2 kodiert Patched 2, einen zwölfmal die Membran durchspannenden Rezeptor, der Hedgehog-Liganden bindet und als zentraler negativer Regulator der Smoothened-(SMO)-Signalübertragung fungiert. Durch die Modulation der Aktivität von GLI-Transkriptionsfaktoren trägt PTCH2 zur Kontrolle der Zellschicksalsfestlegung, Proliferation und Gewebemusterbildung während der Entwicklung bei und bleibt auch für die epitheliale Homöostase in adulten Geweben relevant. Eine fehlregulierte Hedgehog-Signalgebung, einschließlich veränderter PTCH2-Expression oder -Funktion, wurde in mehreren Gewebekontexten mit aberranter Wachstumskontrolle und Tumorbiologie in Verbindung gebracht, was PTCH2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Umverdrahtung von Signalwegen macht. PTCH2 bietet zudem ein gut handhabbares Ziel, um Crosstalk zwischen der Hedgehog-Signalgebung und anderen regulatorischen Programmen zu untersuchen, die Differenzierung und Zellzyklusprogression beeinflussen.

patched 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTCH2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

patched 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTCH2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTCH2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen patched 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTCH2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von patched 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des patched 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTCH2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.