Plásmido CRISPR de Activación (h2) PARD3B: sc-406097-ACT-2

El gen humano PARD3B codifica la proteína homóloga B de “partitioning defective 3”, una proteína de andamiaje de polaridad que se localiza en las uniones célula–célula y coordina el ensamblaje de complejos de polaridad ápico–basal con socios como la PKC atípica y otras proteínas PAR. Mediante interacciones mediadas por dominios PDZ, PARD3B contribuye a regular la organización de las uniones estrechas, la morfogénesis epitelial y la migración direccional al integrar señales de las vías de señalización del citoesqueleto y de pequeñas GTPasas. La alteración de la función de la red de polaridad y de la integridad de las uniones en las que participa PARD3B se ha implicado en procesos relevantes para la progresión tumoral, la invasión y la disfunción de la barrera epitelial. La edición genética de PARD3B permite estudios mecanísticos de la señalización dependiente de la polaridad, la dinámica de las uniones y las transiciones de estado celular en modelos de células humanas mediante estrategias de knockout, knock-in o perturbaciones específicas de dominios.

PARD3B El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PARD3B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PARD3B El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PARD3B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PARD3B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PARD3B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PARD3B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PARD3B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PARD3B en células tumorales con expresión de PARD3B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.