Plasmide CRISPR d'Activation (h) PAR-4: sc-401719-ACT

F2RL3 code le récepteur activé par les protéases 4 (PAR-4), un récepteur couplé aux protéines G activé par la thrombine et d’autres protéases à sérine via un clivage protéolytique qui dévoile un ligand « attaché ». La signalisation de PAR-4 mobilise les voies Gq et G12/13 pour stimuler l’activité de la phospholipase C, la mobilisation du Ca2+ intracellulaire, la signalisation RhoA/ROCK, ainsi que des programmes transcriptionnels en aval dépendants de MAPK et de NF-κB. Dans les plaquettes et les cellules associées au compartiment vasculaire, ces cascades régulent l’activation, la sécrétion, le remodelage du cytosquelette et le dialogue inflammatoire. Une activité dérégulée de PAR-4 et des profils d’expression de F2RL3 ont été associés à des processus liés à la thrombose, à l’inflammation vasculaire et à la signalisation du microenvironnement tumoral, étayant des études mécanistiques à l’interface de l’hémostase et des interactions tumeur–stroma.

PAR-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de F2RL3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PAR-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus F2RL3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription F2RL3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PAR-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus F2RL3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PAR-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PAR-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de F2RL3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.