PAL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408281-ACT

SHCBP1 codifica la proteina SHC binding and spindle associated 1, un fattore associato ai microtubuli e al fuso mitotico implicato nella progressione mitotica e nella citocinesi, con funzioni legate alla dinamica del centrosoma e al controllo del ciclo cellulare. L’attività di SHCBP1 è stata collegata alla segnalazione proliferativa a valle degli adattatori SHC e si interseca con vie che coordinano la segnalazione dei fattori di crescita con il rimodellamento del citoscheletro. Un’espressione deregolata di SHCBP1 è stata riportata in molteplici tipi di tumore ed è frequentemente studiata nel contesto di proliferazione alterata, instabilità cromosomica e fenotipi invasivi. Nei modelli cellulari umani, SHCBP1 rappresenta un nodo utile per indagare i meccanismi che collegano la regolazione della mitosi alla segnalazione oncogenica e alle risposte allo stress.

PAL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SHCBP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SHCBP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SHCBP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SHCBP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAL nelle cellule tumorali con espressione di SHCBP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.