P2Y1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401759-ACT

P2RY1 codifica o recetor humano P2Y1, um recetor purinérgico acoplado à proteína G, ativado principalmente por ADP extracelular. O P2Y1 acopla-se à sinalização Gq/11 para estimular a fosfolipase C, aumentar o Ca2+ intracelular e ativar vias dependentes de PKC que modulam a ativação plaquetária, o tónus vascular e respostas secretórias em múltiplos tipos celulares. Nos sistemas nervoso e imunitário, o P2Y1 contribui para a sinalização neuromoduladora e inflamatória através de uma comunicação cruzada coordenada com outros recetores purinérgicos e com efetores a jusante dependentes de MAPK e de cálcio. A desregulação da sinalização purinérgica envolvendo o P2Y1 tem sido estudada em contextos que incluem biologia relacionada com trombose, homeostase cardiovascular e fenótipos associados à neuroinflamação.

P2Y1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de P2RY1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

P2Y1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus P2RY1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição P2RY1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de P2Y1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus P2RY1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de P2Y1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via P2Y1 em células tumorais com expressão de P2RY1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.