Plasmide CRISPR d'Activation (h) P2Y1: sc-401759-ACT

P2RY1 code pour le récepteur humain P2Y1, un récepteur purinergique couplé aux protéines G, activé principalement par l’ADP extracellulaire. P2Y1 se couple à la signalisation Gq/11 pour stimuler la phospholipase C, augmenter le Ca2+ intracellulaire et activer des voies dépendantes de la PKC, qui modulent l’activation plaquettaire, le tonus vasculaire et les réponses sécrétoires dans de nombreux types cellulaires. Dans les systèmes nerveux et immunitaire, P2Y1 contribue à la neuromodulation et à la signalisation inflammatoire via un dialogue coordonné avec d’autres récepteurs purinergiques ainsi qu’avec des effecteurs en aval de type MAPK et dépendants du calcium. Une signalisation purinergique dérégulée impliquant P2Y1 a été étudiée dans des contextes incluant la biologie liée à la thrombose, l’homéostasie cardiovasculaire et des phénotypes associés à la neuro-inflammation.

P2Y1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de P2RY1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

P2Y1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus P2RY1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription P2RY1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de P2Y1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus P2RY1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de P2Y1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie P2Y1 dans les cellules tumorales présentant une expression de P2RY1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.