P2X6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416264-ACT

Human P2RX6 kodiert die P2X6-Untereinheit ATP-gesteuerter P2X-Ionenkanäle, die als Antwort auf extrazelluläre Nukleotide einen schnellen Kationeneinstrom vermitteln. P2X6 kann zu heteromeren Kanalassemblierungen beitragen, die Ca2+-abhängige Signalwege, die Membranerregbarkeit und nachgeschaltete Transkriptionsprogramme beeinflussen, die mit purinerger Neurotransmission und Immunmodulation verknüpft sind. Über purinerge Signalkaskaden kann eine P2X6-assoziierte Aktivität Prozesse wie die Calciumhomöostase, die vesikuläre Freisetzung und die Integration entzündlicher Signale beeinflussen. Eine dysregulierte Wahrnehmung extrazellulären ATPs und ionotrope purinerge Signalübertragung wurden mit neuroinflammatorischer und kardiovaskulärer Pathophysiologie in Verbindung gebracht, was mechanistische Studien zur Regulation von P2RX6 in relevanten Zelltypen motiviert.

P2X6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen P2RX6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

P2X6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des P2RX6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der P2RX6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen P2X6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native P2RX6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von P2X6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des P2X6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem P2RX6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.