p14ARF/p16 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400018-ACT

CDKN2A kodiert zwei unterschiedliche Tumorsuppressorproteine, p14ARF und p16INK4a, die als koordinierte Kontrollinstanz auf onkogenen Stress hin Zellzyklus-Checkpoints steuern. p16INK4a hemmt CDK4/6, hält dadurch RB in einem hypophosphorylierten Zustand und bremst den Übergang von G1 nach S, während p14ARF die p53-Signalgebung stabilisiert, indem es MDM2 antagonisiert, und so nukleolären Stress mit Apoptose- und Seneszenzprogrammen verknüpft. Veränderte CDKN2A-Expression oder -Inaktivierung ist in der Krebsbiologie häufig mit gestörter Zellzykluskontrolle, beeinträchtigter Seneszenz und genomischer Instabilität assoziiert. Der Genlokus wird zudem breit eingesetzt, um Signalwege zu modellieren, die zelluläres Altern, Proliferation und stressinduzierten Wachstumsarrest regulieren.

p14ARF/p16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDKN2A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p14ARF/p16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDKN2A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDKN2A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p14ARF/p16-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDKN2A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p14ARF/p16-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p14ARF/p16-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDKN2A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.