Plasmide CRISPR d'Activation (h) p14ARF/p16: sc-400018-ACT

CDKN2A code deux protéines suppresseurs de tumeurs distinctes, p14ARF et p16INK4a, qui coordonnent le contrôle des points de contrôle en réponse au stress oncogénique. p16INK4a inhibe CDK4/6 afin de maintenir RB dans un état hypophosphorylé et de freiner la progression de G1 à S, tandis que p14ARF stabilise la signalisation de p53 en s’opposant à MDM2, reliant le stress nucléolaire aux programmes d’apoptose et de sénescence. Une expression altérée de CDKN2A ou son inactivation est fréquemment associée à une dérégulation du contrôle du cycle cellulaire, à une sénescence déficiente et à une instabilité génomique en oncologie. Ce locus est aussi largement utilisé pour modéliser les voies qui régissent le vieillissement cellulaire, la prolifération et l’arrêt de croissance induit par le stress.

p14ARF/p16 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDKN2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p14ARF/p16 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDKN2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDKN2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p14ARF/p16. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDKN2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p14ARF/p16 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p14ARF/p16 dans les cellules tumorales présentant une expression de CDKN2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.