Ox40 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401326-ACT

Das humane TNFRSF4-Gen kodiert OX40 (CD134), ein induzierbares kostimulatorisches Molekül der TNF-Rezeptor-Superfamilie, das vor allem auf aktivierten T-Zellen exprimiert wird, antigengetriebene Antworten verstärkt und die Differenzierung zu Effektor- und Gedächtniszellen unterstützt. Die Bindung von OX40 fördert die Rekrutierung von TRAF-Adaptorproteinen sowie die Aktivierung der Signalwege NF-κB, MAPK und PI3K–AKT und beeinflusst damit Zytokinproduktion, Überleben und Proliferation in der adaptiven Immunität. Eine dysregulierte OX40–OX40L-Signalübertragung wurde mit veränderter Immuntoleranz und inflammatorischen Programmen in Zusammenhang gebracht, wie sie bei Autoimmunerkrankungen, in der Transplantationsbiologie und in Tumor-Immunmikroumgebungen beobachtet werden. TNFRSF4 ist daher ein häufig untersuchtes Ziel in Modellen zur T-Zell-Aktivierung, zu Kostimulations-Checkpoints und zu Immunzell–Zell-Interaktionen.

Ox40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNFRSF4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ox40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNFRSF4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNFRSF4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ox40-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNFRSF4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ox40-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ox40-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNFRSF4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.