OTUD4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412322-ACT

OTUD4 kodiert eine humane Deubiquitinase mit Ovarialtumor-(OTU)-Domäne, die den ubiquitinabhängigen Proteinabbau und die Signalübertragung reguliert, indem sie Ubiquitinketten von Substratproteinen entfernt. Durch die Modulation der Ubiquitinierungsdynamik beeinflusst OTUD4 die Proteostase, Stressantwort-Signalwege sowie die kontextabhängige Kontrolle der angeborenen Immun- und Entzündungssignalgebung. Eine veränderte OTUD4-Aktivität wurde in der Literatur mit fehlregulierten Ubiquitin-Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, die sich mit genomischer Stabilität und Zellschicksalsentscheidungen überschneiden, was OTUD4 für mechanistische Studien in der Krebsbiologie und Neurobiologie relevant macht. Seine enzymatische Rolle in der Deubiquitinierung macht OTUD4 zudem zu einem nützlichen Knotenpunkt, um das Zusammenspiel („Crosstalk“) zwischen Ubiquitin-Remodellierung und transkriptionellen Programmen zu untersuchen.

OTUD4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen OTUD4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

OTUD4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des OTUD4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der OTUD4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen OTUD4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native OTUD4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von OTUD4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des OTUD4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem OTUD4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.