Plasmide CRISPR d'Activation (h) ORP-8: sc-405318-ACT

OSBPL8 code pour la protéine 8 apparentée à la protéine de liaison aux oxystérols (ORP-8), un facteur de transfert lipidique et de détection des stérols qui aide à coordonner la distribution du cholestérol et des phospholipides cellulaires au niveau des sites de contact membranaire, en particulier entre le réticulum endoplasmique et d’autres organites. ORP-8 contribue à la régulation du métabolisme lipidique, de la composition des membranes et de processus de signalisation liés à la gestion des phosphoinositides et au trafic vésiculaire, participant ainsi au maintien de l’homéostasie cellulaire lorsque les conditions nutritives ou de stress varient. Une activité altérée d’ORP-8 a été étudiée dans des contextes impliquant une dérégulation de la gestion des lipides et de la signalisation inflammatoire, fréquemment impliquées dans la biologie des maladies métaboliques et cardiovasculaires ainsi que dans le remodelage métabolique associé aux tumeurs. Dans des modèles cellulaires humains, la modulation d’ORP-8 est donc pertinente pour disséquer les interactions entre voies dépendantes des lipides qui influencent la prolifération, les réponses au stress et la communication entre organites.

ORP-8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de OSBPL8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ORP-8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus OSBPL8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription OSBPL8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ORP-8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus OSBPL8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ORP-8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ORP-8 dans les cellules tumorales présentant une expression de OSBPL8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.