ORMDL3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403587-ACT

ORMDL3 (Orosomucoid-like 3) ist ein Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das als zentraler Regulator der Sphingolipid-Homöostase fungiert, indem es die Aktivität der Serin-Palmitoyltransferase moduliert und dadurch die Ceramidproduktion sowie die Zusammensetzung der Membranlipide beeinflusst. Über seine Rolle im ER-Lipidstoffwechsel wirkt ORMDL3 auf die Kalziumsignalgebung, ER-Stressantworten und den Grundtonus entzündlicher Signalwege und verknüpft damit die zelluläre Homöostase mit der Immunaktivierung. Genetische Varianten und eine dysregulierte Expression von ORMDL3 wurden mit einer erhöhten Asthma-Anfälligkeit und anderen entzündlichen Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für die Atemwegsbiologie und den Immunmetabolismus unterstreicht. Forschende untersuchen ORMDL3 häufig, um zu verstehen, wie lipidgetriebene Signalgebung und ER-Proteostase Zytokinantworten, Epithelfunktion und stressadaptive Programme prägen.

ORMDL3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ORMDL3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ORMDL3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ORMDL3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ORMDL3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ORMDL3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ORMDL3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ORMDL3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ORMDL3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ORMDL3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.