Orexin R-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401613-ACT

HCRTR1 kodiert den Orexin-Rezeptor 1 (Orexin R-1), einen GPCR der Klasse A, der die Neuropeptide Orexin-A und Orexin-B bindet und so Wachheit, die Stabilität des Schlaf-Wach-Rhythmus, Fressverhalten, Belohnungsverarbeitung sowie die neuroendokrine Homöostase reguliert. Nach Ligandenbindung koppelt Orexin R-1 an Gq/11 und weitere G-Proteine, aktiviert PLCβ, erhöht intrazelluläres Ca2+ und stimuliert nachgeschaltete MAPK/ERK-Signalwege; je nach Zellkontext besteht zudem Cross-Talk zu cAMP/PKA- und PI3K-Signalwegen. Diese Signalübertragung beeinflusst die neuronale Erregbarkeit und synaptische Plastizität und integriert hypothalamische Inputs mit übergeordneten neuronalen Netzwerken im Gehirn. Eine fehlregulierte Orexin-Signalgebung und veränderte HCRTR1-Aktivität wurden mit Schlaf- und zirkadianen Phänotypen in Verbindung gebracht und werden häufig im Zusammenhang mit Stressreaktivität, metabolischer Kontrolle sowie signalwegbezogenen Mechanismen neuropsychiatrischer Erkrankungen untersucht.

Orexin R-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HCRTR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Orexin R-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HCRTR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HCRTR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Orexin R-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HCRTR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Orexin R-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Orexin R-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HCRTR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.