Occludin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418271-ACT

Humanes OCLN kodiert Occludin, eine integrale Membrankomponente der Tight-Junction-Stränge, die die parazelluläre Barrierepermeabilität und die Polarität epithelialer Zellen reguliert. Occludin ist über Interaktionen mit ZO-Gerüstproteinen an der Assemblierung und dem Umbau von Zellkontakten beteiligt und ist über Verbindungen zum Aktin-Zytoskelett in Signalwege integriert, darunter Rho-GTPasen sowie PKC- und MAPK-Signalwege. Sein Phosphorylierungszustand beeinflusst die Stabilität der Tight Junctions, die Zell-Zell-Adhäsion und die Reaktion auf entzündliche Signale. Eine dysregulierte OCLN-Expression oder -Lokalisation ist mit Barriere-Defekten assoziiert und trägt in Forschungsmodellen zu intestinalen und Atemwegsentzündungen, zur Integrität der Blut-Hirn-Schranke sowie zur epithelial-mesenchymalen Transition bei.

Occludin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen OCLN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Occludin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des OCLN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der OCLN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Occludin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native OCLN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Occludin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Occludin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem OCLN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.