Plásmido CRISPR de Activación (m) O-GlcNAc transferase: sc-430829-ACT

Ogt codifica la O‑GlcNAc transferasa (OGT), la enzima esencial nucleocitoplasmática que cataliza la adición de β‑N‑acetilglucosamina O‑enlazada (O‑GlcNAc) a residuos de serina/treonina en diversos sustratos proteicos. Esta modificación postraduccional dinámica integra el estado nutricional celular a través de la vía biosintética de las hexosaminas y modula la señalización, la transcripción, la regulación de la cromatina, la proteostasis y el control del ciclo celular. La O‑GlcNAcilación mediada por OGT interactúa con la fosforilación para ajustar con precisión las cascadas de quinasas y los programas de respuesta al estrés, influyendo en la diferenciación y la función neuronal. La desregulación del ciclo de O‑GlcNAc se ha asociado con mecanismos de enfermedades metabólicas y neurodegenerativas, así como con redes de señalización oncogénica, lo que convierte a Ogt en un nodo central para estudios centrados en vías en sistemas murinos.

O-GlcNAc transferase El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ogt sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

O-GlcNAc transferase El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ogt en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ogt, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de O-GlcNAc transferase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ogt y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de O-GlcNAc transferase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía O-GlcNAc transferase en células tumorales con expresión de Ogt silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.