NT-3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421978-ACT

Das murine Ntf3-Gen kodiert Neurotrophin-3 (NT-3), einen sezernierten Wachstumsfaktor, der während der Entwicklung und in adulten Geweben das Überleben von Neuronen, deren Differenzierung und die synaptische Konnektivität reguliert. NT-3 signalisiert vor allem über die Rezeptor-Tyrosinkinase TRKC/NTRK3 und aktiviert dabei die MAPK/ERK-, PI3K–AKT- und PLCγ-Kaskaden, die Axonleitung, Neuritenauswachsung und aktivitätsabhängige Plastizität steuern. Über das Nervensystem hinaus beeinflusst NT-3 die Ausbildung propriozeptiver Schaltkreise sowie die Aufrechterhaltung peripherer Nerven und kann neuroimmunologische Interaktionen in Gewebemikroumgebungen modulieren. Eine fehlregulierte Neurotrophin-Signalgebung ist relevant für Untersuchungen neuroentwicklungsbezogener Phänotypen, von Neurodegeneration und von Reaktionen auf Nervenverletzungen, bei denen veränderte trophische Unterstützung und das Gleichgewicht der Rezeptor-Signalwege das Zellschicksal und die Konnektivität beeinflussen.

NT-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ntf3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NT-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ntf3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ntf3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NT-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ntf3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NT-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NT-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ntf3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.