Plasmide CRISPR d'Activation (h) Npl4: sc-403787-ACT

Le gène humain **NPLOC4** code Npl4, un cofacteur essentiel de l’ATPase p97/VCP qui agit avec UFD1 pour reconnaître et extraire des substrats ubiquitinylés en vue de leur prise en charge par le protéasome. Grâce à ses domaines de liaison à l’ubiquitine, Npl4 contribue à coordonner la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD), l’élimination des chaînes naissantes associées aux ribosomes bloqués, ainsi qu’un contrôle plus global de la protéostasie qui influence la progression du cycle cellulaire et la signalisation d’adaptation au stress. Ces voies recoupent les réponses aux dommages de l’ADN et les programmes transcriptionnels inflammatoires en régulant le renouvellement de protéines clés de signalisation et associées à la chromatine. La dérégulation de l’axe VCP–UFD1–NPL4 est liée au stress protéotoxique, à une homéostasie protéique altérée et à une vulnérabilité accrue dans des états prolifératifs, ce qui fait de **NPLOC4** une cible pertinente pour des études mécanistiques en neurodégénérescence et en biologie du cancer.

Npl4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NPLOC4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Npl4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NPLOC4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NPLOC4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Npl4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NPLOC4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Npl4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Npl4 dans les cellules tumorales présentant une expression de NPLOC4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.