Nox5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401223-ACT

NOX5 kodiert Nox5, eine calciumaktivierte NADPH-Oxidase, die die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) katalysiert und dadurch redoxsensitive Signalwege moduliert. Von Nox5 abgeleitete ROS beeinflussen Signalwege, die Zellproliferation, Migration, Zytoskelett-Umbau und Entzündungsreaktionen steuern, indem sie Kinasen, Phosphatasen und Transkriptionsfaktoren oxidationsabhängig regulieren. In menschlichen Geweben wurde die NOX5-Aktivität mit Signalprozessen in Endothel- und glatten Muskelzellen, der Aktivierung von Immunzellen und der Biologie des oxidativen Stresses in Verbindung gebracht. Eine fehlregulierte NOX5-Expression oder -Aktivität wird häufig im Kontext kardiovaskulärer Funktionsstörungen, chronischer Entzündung und tumorassoziierter Redox-Remodellierung untersucht, bei denen eine veränderte ROS-Homöostase krankheitsrelevante zelluläre Phänotypen beeinflusst.

Nox5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NOX5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nox5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NOX5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NOX5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nox5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NOX5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nox5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nox5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NOX5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.