Notch 3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400424-ACT

NOTCH3 kodiert Notch 3, einen Single-Pass-Transmembranrezeptor, der als Antwort auf Delta-like- und Jagged-Liganden die juxtakrine Notch-Signalübertragung vermittelt. Nach Ligandenbindung führt eine proteolytische Prozessierung zur Freisetzung der intrazellulären Notch-Domäne, die in den Zellkern transloziert und dort zusammen mit RBPJ/CSL und Koaktivatoren Transkriptionsprogramme reguliert, welche die Festlegung des Zellschicksals, die Differenzierung und die Gewebehomöostase steuern. Die Aktivität von Notch 3 ist eng mit der Biologie vaskulärer glatter Muskelzellen und mit übergeordneten entwicklungsbiologischen Signalnetzwerken verknüpft, und eine Fehlregulation der NOTCH3-abhängigen Transkription wurde sowohl mit erblichen Arteriopathien als auch mit onkogenen Kontexten in Verbindung gebracht. Als Knotenpunkt in Signalwegen bietet NOTCH3 ein gut zugängliches Modell zur Untersuchung der Dynamik der Rezeptoraktivierung, des transkriptionellen Outputs sowie des Crosstalks mit MAPK-, PI3K-AKT- und TGF-β-assoziierten Prozessen.

Notch 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NOTCH3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Notch 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NOTCH3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NOTCH3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Notch 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NOTCH3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Notch 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Notch 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NOTCH3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.