Nidogen CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403387-ACT

Das humane Gen NID1 kodiert Nidogen-1, ein sulfatiertes Glykoprotein der Basalmembranen, das Laminin- und Typ-IV-Kollagen-Netzwerke miteinander verbindet und so die Architektur der extrazellulären Matrix stabilisiert. Nidogen ist an der Zell-Matrix-Adhäsion, der Gewebekompartimentierung sowie an der basalmembranabhängigen Regulation von Migration, Differenzierung und Polarität beteiligt und beeinflusst dabei Signalweg-Wechselwirkungen mit Integrin/FAK- und Wachstumsfaktor-Signalwegen. Eine veränderte Menge oder Organisation von Nidogen wurde mit einer gestörten Barriereintegrität und Umbauprogrammen in Verbindung gebracht, wie sie bei Fibrose, Tumorinvasion sowie in der vaskulären oder renalen Pathobiologie beobachtet werden. Als zentraler Basalmembran-Linker wird NID1 häufig in Studien zu epithelial-stromalen Interaktionen, Angiogenese und Matrixmechanik untersucht.

Nidogen Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NID1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nidogen Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NID1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NID1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nidogen-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NID1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nidogen-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nidogen-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NID1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.