NHE-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400748-ACT

SLC9A1 kodiert den menschlichen Na+/H+-Austauscher 1 (NHE-1), einen Antiporter der Plasmamembran, der intrazelluläre H+-Ionen im Austausch gegen extrazelluläres Na+ aus der Zelle befördert, um den zytosolischen pH-Wert aufrechtzuerhalten, das Zellvolumen zu regulieren und die Ionenhomöostase zu unterstützen. Die Aktivität von NHE-1 ist mit Wachstumsfaktor-Signalen und dem Umbau des Zytoskeletts verknüpft und beeinflusst dadurch Proliferation, Migration und Stressanpassung; zudem trägt sie zur pH-abhängigen Kontrolle von Stoffwechsel und Enzymaktivität bei. Eine fehlregulierte NHE-1-Funktion und gestörte pH-Homöostase wurden sowohl in der Krebsbiologie mit veränderten Programmen für Zellüberleben und Motilität als auch in der kardiovaskulären und neurologischen Forschung mit Ischämie-bedingten Schadensmechanismen in Verbindung gebracht. Da NHE-1 Ionentransport mit Signaloutputs koppelt, wird SLC9A1 häufig in Signalwegen untersucht, die MAPK/ERK, Rho-GTPasen sowie zelluläre Antworten auf Hypoxie und oxidativen Stress betreffen.

NHE-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC9A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NHE-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC9A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC9A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NHE-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC9A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NHE-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NHE-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC9A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.