NF-L CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402254-ACT

NEFL kodiert das Neurofilament-Leichtkettenprotein (NF‑L), einen zentralen Bestandteil intermediärer Filamente, der sich mit anderen Neurofilament-Untereinheiten zu Filamenten zusammenlagert, um den Axondurchmesser, die mechanische Stabilität und einen effizienten Langstreckentransport in Neuronen aufrechtzuerhalten. Die Dynamik von NF‑L ist mit dem Umbau des Zytoskeletts, der Axonführung sowie einer phosphorylierungsabhängigen Filamentorganisation gekoppelt, die die neuronale Integrität und synaptische Konnektivität unterstützt. Veränderte NEFL-Expression oder Störungen des Neurofilamentnetzwerks stehen mit Neurodegeneration und peripheren Neuropathien in Zusammenhang, und die Menge an NF‑L wird in Modellsystemen häufig als Forschungsmarker für neuronale Schädigung und axonale Degeneration verwendet. Diese Eigenschaften machen NEFL zu einem relevanten Ziel für die Untersuchung der Zytoskelettregulation, von Signalwegen zur Axonerhaltung und von Mechanismen, die die neuronale Widerstandsfähigkeit beeinflussen.

NF-L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEFL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NF-L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEFL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEFL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NF-L-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEFL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NF-L-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NF-L-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEFL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.