Neurofibromin 2/NF2/Merlin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400504-ACT

NF2 codifica merlin (neurofibromina 2), un oncosoppressore associato alla membrana che collega il citoscheletro corticale di actina ai recettori transmembrana e ai complessi giunzionali, regolando l’inibizione da contatto e la meccanica cellulare. Merlin modula la segnalazione della via Hippo limitando l’attività di YAP/TAZ e interagisce con le reti delle tirosin-chinasi recettoriali, PI3K–AKT e MAPK per coordinare proliferazione, migrazione e polarità. Contribuisce inoltre alla stabilità delle giunzioni aderenti e delle tight junction, influenzando l’architettura tissutale e le risposte di meccanotrasduzione. L’alterazione della funzione di NF2 è implicata nella neurofibromatosi di tipo 2 e in uno spettro di tumori con deficit di merlin, rendendo NF2 un nodo chiave per lo studio del controllo della crescita e della segnalazione citoscheletrica.

Neurofibromin 2/NF2/Merlin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Neurofibromin 2/NF2/Merlin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Neurofibromin 2/NF2/Merlin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Neurofibromin 2/NF2/Merlin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Neurofibromin 2/NF2/Merlin nelle cellule tumorali con espressione di NF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.