netrin-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403229-ACT

Das humane Gen **NTN4** kodiert **Netrin-4**, einen sezernierten, lamininverwandten Leitsignal-Faktor, der in Basalmembranen angereichert ist und Zelladhäsion, Migration und Gewebemusterbildung moduliert. Netrin-4 interagiert mit Rezeptoren und Komponenten der extrazellulären Matrix, um Programme der Axonleitung, die vaskuläre Morphogenese sowie epithelial-endotheliale Interaktionen zu beeinflussen – mit nachgeschalteten Effekten auf die Umgestaltung des Zytoskeletts und die Organisation der extrazellulären Matrix. Im Gefäß- und Nervensystem wurde eine veränderte **NTN4**-Expression mit fehlregulierter angiogener Signalgebung, Barriereigenschaften und Umbauprozessen in Verbindung gebracht, die für Entwicklungsanomalien und komplexe Krankheitsmechanismen relevant sind.

netrin-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NTN4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

netrin-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NTN4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NTN4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen netrin-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NTN4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von netrin-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des netrin-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NTN4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.