NELF-A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401058-ACT

NELFA kodiert NELF-A, eine zentrale Untereinheit des Negative-Elongation-Factor-(NELF)-Komplexes, der mit DSIF zusammenwirkt, um ein promotor-nahes Pausieren der RNA-Polymerase II zu etablieren und die transkriptionelle Elongation zu regulieren. Über diesen Kontrollpunkt hilft NELF-A, schnell stimulusresponsive Genprogramme zu koordinieren, indem es die Transkriptionsinitiation mit produktiver Elongation und RNA-Prozessierung im Zellkern koppelt. Das durch NELF vermittelte Pausieren beeinflusst den Chromatinzustand und die Transkriptionsfidelität und prägt Signalwege, die an Zellzykluskontrolle, Differenzierung und Stressantworten beteiligt sind. Eine Dysregulation der Kontrolle der transkriptionellen Elongation wurde mit aberranten Genexpressionsprogrammen bei Krebs sowie mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was den Einsatz von NELFA-Perturbationen zur Untersuchung krankheitsrelevanter transkriptioneller Schaltkreise unterstützt.

NELF-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NELFA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NELF-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NELFA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NELFA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NELF-A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NELFA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NELF-A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NELF-A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NELFA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.