Nek11 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404923-ACT

Das humane Gen **NEK11** kodiert die Serin/Threonin-Kinase Nek11, eine mit NIMA verwandte Kinase, die an der Kontrolle von Zellzyklus-Checkpoints und der DNA-Schadensantwort beteiligt ist. Nek11 wirkt nachgeschaltet der ATR/Chk1-Signalkaskade und reguliert den Übergang von G2 nach M, indem es die Stabilität und Aktivität zentraler mitotischer Regulatoren – darunter CDC25A – moduliert und so Replikationsstress-Antworten sowie den rechtzeitigen Eintritt in die Mitose koordiniert. Über diese Funktionen trägt NEK11 zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität bei und beeinflusst die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber genotoxischem Stress. Eine fehlregulierte Checkpoint-Signalgebung und eine veränderte NEK11-Aktivität wurden mit proliferativen Phänotypen und genomischer Instabilität in verschiedenen krebsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht.

Nek11 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEK11-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nek11 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEK11-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEK11-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nek11-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEK11-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nek11-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nek11-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEK11-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.