N-WASP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401440-ACT

WASL kodiert das humane N-WASP, ein multidomainiges Aktin-Regulationsprotein, das die Signalwege von GTPasen der Rho-Familie und Phosphoinositiden mit der Arp2/3-vermittelten, verzweigten Aktin-Nukleation koppelt. Durch die Koordination des Zytoskelett-Remodelings unterstützt N-WASP Prozesse wie clathrinvermittelte Endozytose, Membranprotrusion und Zellmigration, Adhäsionsdynamik sowie die Organisation der immunologischen Synapse. Die N-WASP-Aktivität integriert Signale von Cdc42, SH3-Domänen-Adaptoren und Tyrosinkinasen, um die Aktinassemblierung als Antwort auf extrazelluläre Reize feinzujustieren. Eine dysregulierte WASL/N-WASP-Funktion wurde mit veränderter Zellmotilität und invasivem Verhalten, neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen im Zusammenhang mit synaptischer Aktindynamik sowie Defekten in der Signalübertragung von Immunzellen in Verbindung mit Entzündung und Wirt–Pathogen-Interaktionen in Zusammenhang gebracht.

N-WASP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WASL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

N-WASP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WASL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WASL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen N-WASP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WASL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von N-WASP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des N-WASP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WASL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.