Myosin Va CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402108-ACT

MYO5A kodiert das aktinbasierte Motorprotein Myosin Va, ein prozessives Myosin, das die ATP-Hydrolyse an den Langstreckentransport membrangebundener Organellen und Proteinkomplexe entlang von Aktinfilamenten koppelt. In menschlichen Zellen unterstützt Myosin Va den Vesikeltransport, endo-/exozytische Transportwege und die polarisierte Abgabe von Fracht und trägt damit zur Organisation des Zytoskeletts sowie zur räumlichen Kontrolle der Signalübertragung an der Zellperipherie bei. Der MYO5A-abhängige Transport steht in Wechselwirkung mit Rab-GTPase-regulierten Signalwegen und der SNARE-vermittelten Membranfusion, um sekretorische Granula, Rezeptoren sowie mRNA-/Protein-Komplexe zu positionieren. Eine Störung oder Fehlregulation von MYO5A wurde mit Defekten im intrazellulären Transport in Verbindung gebracht, die neuronale Funktionen und pigmentbezogene Biologie beeinträchtigen können, was MYO5A für mechanistische Studien zu trafficking-assoziierten Krankheitsphänotypen relevant macht.

Myosin Va Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MYO5A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Myosin Va Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MYO5A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MYO5A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Myosin Va-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MYO5A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Myosin Va-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Myosin Va-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MYO5A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.