Plasmide CRISPR d'Activation (m) MRP-S25: sc-425723-ACT

Mrps25 code la protéine ribosomique mitochondriale murine MRP-S25, un composant de la petite sous-unité du mitoribosome, indispensable à la traduction des sous-unités de la phosphorylation oxydative codées par le génome mitochondrial. En soutenant la synthèse des protéines mitochondriales, MRP-S25 contribue à l’assemblage de la chaîne respiratoire, à la production d’ATP et au maintien du potentiel de membrane mitochondrial, ce qui la relie à des voies centrales de bioénergétique et de protéostasie. La perturbation des protéines mitoribosomiques peut altérer la phosphorylation oxydative et augmenter les espèces réactives de l’oxygène, des processus impliqués dans des phénotypes neuromusculaires et métaboliques ainsi que dans des réponses au stress pertinentes pour le métabolisme des cellules cancéreuses. La régulation de Mrps25 présente donc un intérêt pour étudier le contrôle de la traduction mitochondriale et ses effets en aval sur la fitness cellulaire.

MRP-S25 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Mrps25 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MRP-S25 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Mrps25 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Mrps25, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MRP-S25. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Mrps25 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MRP-S25 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MRP-S25 dans les cellules tumorales présentant une expression de Mrps25 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.