Mms2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404777-ACT

UBE2V2 kodiert Mms2, eine Variante eines E2-Ubiquitin-konjugierenden Enzyms, der die katalytische Aktivität fehlt, die jedoch mit UBE2N/UBC13 ein funktionelles Heterodimer bildet und dadurch den Aufbau K63-verknüpfter Polyubiquitin-Ketten fördert. Diese nicht-proteolytische Ubiquitin-Signalgebung unterstützt die Toleranz gegenüber DNA-Schäden und deren Reparatur, einschließlich der Postreplikationsreparatur und des fehlerfreien Lesions-Bypasses, der durch die Ubiquitinierung von PCNA vermittelt wird. Die Mms2-abhängige Ubiquitin-Kettenbildung trägt außerdem zu stressresponsiven Signalnetzwerken bei, die mit Genomstabilität und der Kontrolle von Zellzyklus-Checkpoints verknüpft sind. Eine Fehlregulation ubiquitinvermittelter DNA-Reparaturwege unter Beteiligung von UBE2V2 wurde mit einer veränderten Mutationslast und einer veränderten zellulären Empfindlichkeit gegenüber genotoxischem Stress in Verbindung gebracht, wodurch UBE2V2 für mechanistische Studien in der Krebsbiologie und bei DNA-Reparaturerkrankungen relevant ist.

Mms2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBE2V2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Mms2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBE2V2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBE2V2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Mms2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBE2V2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Mms2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Mms2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBE2V2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.