MKLP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400696-ACT

KIF23 kodiert das kinesinbasierte Motorprotein MKLP-1, eine zentrale Komponente des Centralspindlin-Komplexes, der während der Zytokinese den Aufbau der zentralen Spindel und die Bildung des Midbodies koordiniert. MKLP-1 verknüpft mikrotubulusbasierten Transport mit der RhoA-Signalgebung, um die Positionierung der Teilungsfurche zu steuern und die Dynamik des kontraktilen Rings zu regulieren, wodurch eine korrekte Chromosomensegregation und das Fortschreiten des Zellzyklus unterstützt werden. Eine dysregulierte KIF23/MKLP-1-Aktivität wird mit fehlerhafter Mitose, Aneuploidie und veränderten Proliferationszuständen in Verbindung gebracht und ist daher relevant für Studien zur Tumorzellteilung, genomischen Instabilität und Kontrolle von Zellzyklus-Checkpoints. Da MKLP-1 an der Schnittstelle zwischen Spindelmechanik und kortikalem Remodeling wirkt, wird es häufig eingesetzt, um Signalwege zu untersuchen, die den mitotischen Austritt und die zytokinetische Abspaltung (Abszission) steuern.

MKLP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KIF23-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MKLP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KIF23-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KIF23-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MKLP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KIF23-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MKLP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MKLP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KIF23-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.