MAD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401885-ACT

Das humane Gen **MAD1L1** kodiert das „mitotic arrest deficient 1“ (MAD1), eine zentrale Komponente des Spindelkontrollpunkts (Spindle Assembly Checkpoint), der die Chromosomentrennung absichert, indem er die Anheftung von Kinetochoren an Mikrotubuli überwacht. MAD1 wirkt mit MAD2 und weiteren Checkpoint-Faktoren zusammen, um die Bildung des mitotischen Checkpoint-Komplexes zu fördern und die APC/C-CDC20-Aktivität zu hemmen, bis die korrekte Biorientierung erreicht ist. Dadurch werden Aneuploidie und chromosomale Instabilität begrenzt. Aufgrund seiner Funktionen in der zeitlichen Steuerung der Mitose und in der Checkpoint-Signalübertragung wird MAD1L1 häufig in Signalwegen untersucht, die Genomstabilität mit dem Fortschreiten des Zellzyklus verknüpfen. Eine Fehlregulation der mit MAD1L1 assoziierten Checkpoint-Kontrolle wird mit Phänotypen chromosomaler Instabilität in verschiedenen Krebskontexten sowie in Modellen beeinträchtigter mitotischer Genauigkeit in Verbindung gebracht.

MAD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAD1L1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MAD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAD1L1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAD1L1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MAD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAD1L1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MAD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MAD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAD1L1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.