LGR4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402643-ACT

Humanes LGR4 (leucinreiche Repeat-enthaltender G‑Protein‑gekoppelter Rezeptor 4) ist ein Membranrezeptor, der als zentraler Modulator der durch R‑Spondin verstärkten Wnt/β‑Catenin-Signalübertragung fungiert, indem er die Stabilität von Rezeptorkomplexen an der Zelloberfläche beeinflusst. Über diese Achse trägt LGR4 zur Regulation von Zellproliferation, Differenzierung und Gewebehomöostase bei, mit nachgelagerten Effekten auf das Verhalten von Stamm-/Vorläuferzellen und das epitheliale Remodeling. Die Aktivität von LGR4 überschneidet sich mit Signalwegen, die Zellschicksalsentscheidungen und morphogengesteuerte Musterbildung kontrollieren, wodurch es für Studien der Entwicklungsbiologie und regenerativer Prozesse relevant ist. Fehlregulierte Wnt-Signalinputs unter Beteiligung von LGR4 wurden in krankheitsbezogenen Kontexten mit veränderter Wachstumskontrolle und Spezifizierung von Zelllinien in Verbindung gebracht.

LGR4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LGR4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LGR4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LGR4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LGR4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LGR4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LGR4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LGR4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LGR4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LGR4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.