LGR4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402643-ACT

O LGR4 humano (receptor acoplado à proteína G contendo repetições ricas em leucina 4) é um receptor de membrana que atua como um modulador-chave da sinalização Wnt/β-catenina potencializada por R-spondina, ao influenciar a estabilidade do complexo de receptores na superfície celular. Por meio desse eixo, o LGR4 ajuda a regular a proliferação e a diferenciação celulares e a homeostase tecidual, com efeitos a jusante sobre o comportamento de células-tronco/progenitoras e o remodelamento epitelial. A atividade do LGR4 se cruza com vias que controlam decisões de destino celular e o padrãoamento guiado por morfógenos, o que o torna relevante para estudos de biologia do desenvolvimento e processos regenerativos. Alterações na entrada de sinais da via Wnt envolvendo o LGR4 têm sido associadas a mudanças no controle do crescimento e na especificação de linhagens em contextos relacionados a doenças.

LGR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LGR4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LGR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LGR4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LGR4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LGR4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LGR4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LGR4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LGR4 em células tumorais com expressão de LGR4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.