Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ketohexokinase: sc-403399-ACT

Le gène humain **KHK** code la **ketohexokinase**, une fructokinase particulièrement abondante dans le foie et les reins, qui catalyse la phosphorylation du fructose en **fructose-1-phosphate**, initiant ainsi le métabolisme du fructose et couplant les flux glucidiques aux voies glycolytiques et lipogéniques en aval. En régulant la prise en charge cellulaire du fructose alimentaire, KHK influence l’utilisation de l’ATP, l’homéostasie du phosphate et l’orientation des métabolites vers la synthèse des triglycérides et le renouvellement des purines lié à l’acide urique. Une activité de KHK altérée a été associée à des erreurs innées du métabolisme du fructose ainsi qu’à des phénotypes métaboliques impliquant une accumulation lipidique hépatique et une signalisation liée à la résistance à l’insuline. En tant que nœud du métabolisme du carbone induit par le fructose, KHK est largement étudiée dans la détection des nutriments, la reprogrammation métabolique des hépatocytes et les réponses au stress liées à une forte exposition au fructose.

Ketohexokinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KHK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ketohexokinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KHK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KHK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ketohexokinase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KHK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ketohexokinase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ketohexokinase dans les cellules tumorales présentant une expression de KHK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.