KCC4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405528-ACT

SLC12A7 kodiert den menschlichen KCC4 (K–Cl-Cotransporter 4), einen elektroneutralen Transporter, der den Efflux von K+ und Cl− koppelt, um intrazelluläres Chlorid, die Homöostase des Zellvolumens und die Membranerregbarkeit zu regulieren. Die Aktivität von KCC4 trägt zum epithelialen Ionentransport und zu pH-abhängigen Prozessen bei und beeinflusst so das osmotische Gleichgewicht sowie chloridabhängige Signalwege in unterschiedlichen Geweben. Durch die Modulation von Cl−-Gradienten kann KCC4 die neuronale Inhibition und zytoskelettale Dynamiken beeinflussen, die mit Migrations- und Invasionsphänotypen verknüpft sind. Eine veränderte Expression von SLC12A7/KCC4 wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, was seine Untersuchung in Mechanismen des dysregulierten Ionentransports, zellulärer Stressantworten und des Gewebeumbaus unterstützt.

KCC4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC12A7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KCC4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC12A7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC12A7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KCC4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC12A7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KCC4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KCC4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC12A7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.