Plasmide CRISPR d'Activation (h) karyopherin β1: sc-401230-ACT

KPNB1 code la karyophérine β1 (importine β1), un récepteur central du transport nucléaire qui se lie aux complexes importine α–cargo et assure une translocation dépendante de la GTPase Ran à travers le complexe du pore nucléaire. En contrôlant l’import nucléaire de facteurs de transcription, de régulateurs du cycle cellulaire et de protéines de la réponse aux dommages de l’ADN, KPNB1 contribue à coordonner les programmes transcriptionnels, la progression mitotique et la signalisation liée au stress. Des altérations du trafic nucléo‑cytoplasmique constituent une caractéristique récurrente des phénotypes prolifératifs et neurodégénératifs, et une expression ou une activité dérégulée de KPNB1 a été associée à des perturbations du contrôle de la croissance et des voies de maintien du génome dans de multiples contextes pathologiques.

karyopherin β1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KPNB1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

karyopherin β1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KPNB1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KPNB1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de karyopherin β1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KPNB1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de karyopherin β1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie karyopherin β1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KPNB1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.