Plasmide CRISPR d'Activation (h) IP3R-III: sc-402138-ACT

ITPR3 code le récepteur de l’inositol 1,4,5-trisphosphate de type 3 (IP3R-III), un canal de libération de Ca²⁺ du réticulum endoplasmique qui s’ouvre en réponse à l’IP3 généré en aval de la signalisation de la phospholipase C. En modulant les oscillations intracellulaires de Ca²⁺ et la signalisation au niveau de microdomaines, IP3R-III régule la sécrétion, la polarité épithéliale, le métabolisme mitochondrial et des programmes transcriptionnels dépendants du Ca²⁺. La fonction d’IP3R-III recoupe des voies impliquant les GPCR et les récepteurs à activité tyrosine kinase, reliant des signaux extracellulaires à la dynamique du Ca²⁺ du RE et à des effecteurs en aval tels que les kinases dépendantes de la calmoduline et la signalisation NFAT. Une expression altérée d’ITPR3 ou une homéostasie du Ca²⁺ perturbée a été associée à une prolifération déréglée, à des réponses au stress et à un remodelage épithélial dans de multiples contextes pertinents pour la maladie, ce qui étaye des études mécanistiques des réseaux de signalisation du Ca²⁺.

IP3R-III Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ITPR3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IP3R-III Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ITPR3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ITPR3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IP3R-III. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ITPR3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IP3R-III au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IP3R-III dans les cellules tumorales présentant une expression de ITPR3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.