IDO CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421024-ACT

Das murine Ido1-Gen kodiert die Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO), ein hämabhängiges Enzym, das den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Tryptophanabbaus über den Kynureninweg katalysiert. Durch die Regulation der lokalen Tryptophanverfügbarkeit und die Bildung bioaktiver Kynureninmetabolite beeinflusst IDO die Aktivierung von Immunzellen, die Antigenpräsentation sowie entzündliche Signalprogramme, einschließlich Signalwegen, die mit der Aktivität des Aryl-Hydrocarbon-Rezeptors (AHR) und zellulären Stressantworten verknüpft sind. Die Expression von Ido1 wird häufig durch Interferon-γ und andere entzündliche Reize induziert und ist damit mit Mechanismen der Immuntoleranz und der Gewebehomöostase verbunden. Eine fehlregulierte IDO-Aktivität wurde mit Tumor-Immunflucht, chronisch infektionsassoziierter Entzündung, immunregulatorischen Prozessen bei Autoimmunität sowie neuroinflammatorischen Vorgängen in Verbindung gebracht und stellt daher einen wichtigen Ansatzpunkt für die Forschung zur Immunmetabolik dar.

IDO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ido1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IDO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ido1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ido1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IDO-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ido1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IDO-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IDO-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ido1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.