IDH3G CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404994-ACT

IDH3G kodiert die Gamma-Untereinheit der NAD-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase 3 (IDH3), eines Enzymkomplexes in der mitochondrialen Matrix, der im Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus) die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu α‑Ketoglutarat katalysiert. Durch seinen Beitrag zur NADH-Produktion unterstützt IDH3G die mitochondriale Atmung, das Redoxgleichgewicht und den Stofffluss, der den Kohlenhydratabbau mit biosynthetischen und Signalwegen verknüpft. Eine veränderte Regulation von TCA-Zyklus-Enzymen kann die Verfügbarkeit von α‑Ketoglutarat und die mitochondriale Funktion verschieben und dadurch Stressantworten und zelluläre Differenzierungszustände beeinflussen. Eine dysregulierte mitochondriale Stoffwechselaktivität und Störungen des TCA-Zyklus sind wiederkehrende Merkmale in der Krebsbiologie und bei anderen Erkrankungen mit beeinträchtigtem oxidativem Stoffwechsel, weshalb IDH3G ein relevanter Ansatzpunkt für mechanistische Studien ist.

IDH3G Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IDH3G-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IDH3G Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IDH3G-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IDH3G-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IDH3G-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IDH3G-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IDH3G-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IDH3G-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IDH3G-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.