ICAD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403560-ACT

DFFA kodiert die DNA-Fragmentierungsfaktor‑Untereinheit alpha (ICAD), ein Chaperon und Inhibitor von CAD/DFFB, das die apoptotische DNA-Fragmentierung steuert. In gesunden Zellen stabilisiert ICAD CAD und verhindert eine vorzeitige Nukleaseaktivität; während der Apoptose führt die durch Caspase‑3 vermittelte Spaltung von ICAD zur Freisetzung von aktivem CAD, das internukleosomale DNA‑Brüche erzeugt. Diese Achse ist in die intrinsische und extrinsische Apoptose-Signalgebung eingebunden und verknüpft Caspasenkaskaden mit dem Abbau des Chromatins sowie Veränderungen der Kernmorphologie. Eine Fehlregulation der DFFA/CAD-Kontrolle wurde mit veränderter Empfindlichkeit gegenüber Zelltod und Phänotypen der Genomintegrität in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie, immunvermittelte Gewebeschädigung und die Neurodegenerationsforschung relevant sind.

ICAD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DFFA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ICAD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DFFA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DFFA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ICAD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DFFA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ICAD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ICAD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DFFA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.