Plásmido CRISPR de Activación (h) HYPE: sc-406626-ACT

El FICD humano codifica HYPE, una enzima con dominio Fic localizada en el retículo endoplásmico que cataliza la AMPilación y des-AMPilación reversibles de sustratos proteicos, de manera destacada la chaperona HSPA5/BiP. Al modular la actividad de BiP, HYPE configura la proteostasis del RE, la señalización de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) y programas adaptativos de estrés que influyen en la capacidad de plegamiento y secreción de proteínas. Este eje regulador vincula a FICD con vías que controlan la homeostasis del RE, el manejo del calcio y la supervivencia celular bajo estrés proteotóxico. La desregulación del estrés del RE y de la señalización UPR está implicada en la neurodegeneración, la disfunción metabólica y fenotipos relevantes para el cáncer, lo que convierte a FICD/HYPE en un nodo útil para estudios mecanísticos de la proteostasis.

HYPE El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FICD sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HYPE El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FICD en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FICD, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HYPE. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FICD y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HYPE en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HYPE en células tumorales con expresión de FICD silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.