Hus1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403287-ACT

Das menschliche HUS1-Gen kodiert Hus1, eine zentrale Komponente der 9-1-1-Checkpoint-Klammer (RAD9A–RAD1–HUS1), die an geschädigte DNA geladen wird, um die Genomüberwachung zu koordinieren. Dieser Komplex fördert die ATR-abhängige Signalübertragung, unterstützt die Stabilisierung von Replikationsgabeln und erleichtert über Interaktionen mit Mediatoren wie TOPBP1 sowie zahlreichen Reparaturfaktoren die Auswahl des DNA-Reparaturwegs. Indem Hus1 die Erkennung von DNA-Schäden mit der Kontrolle des Zellzyklus-Checkpoints verknüpft, trägt es dazu bei, replikationsassoziierte genomische Instabilität zu begrenzen. Eine Fehlregulation der 9-1-1/ATR-Checkpoint-Prozesse wird häufig im Zusammenhang mit Mutationslast, Phänotypen chromosomaler Instabilität und Defekten der DNA-Schadensantwort untersucht, die für die Krebsbiologie und erbliche Störungen der Genomstabilität relevant sind.

Hus1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HUS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Hus1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HUS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HUS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Hus1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HUS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Hus1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Hus1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HUS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.