HURP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402206-ACT

DLGAP5 kodiert HURP, ein mikrotubuliassoziiertes Protein, das sich an Kinetochorfasern anreichert und Spindelmikrotubuli stabilisiert, um die Chromosomenkongression und eine präzise Segregation während der Mitose zu unterstützen. HURP wird durch Zellzykluskinasen sowie den Ran-GTP/Importin-Signalweg reguliert und integriert Signale, die den Aufbau der Spindel mit dem Fortschreiten durch die G2/M-Phase koordinieren. Aufgrund seiner Funktionen in der Spindeldynamik und der Integrität des mitotischen Checkpoints ist eine fehlregulierte HURP-Expression mit proliferativen Phänotypen und genomischer Instabilität verbunden, wie sie in verschiedenen Krebszusammenhängen beobachtet werden. In menschlichen Zellmodellen wird DLGAP5/HURP häufig als Readout für mitotische Kontrolle, Aneuploidie-Toleranz und Stressantworten auf mikrotubuli-targetierende Wirkstoffe untersucht.

HURP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DLGAP5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HURP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DLGAP5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DLGAP5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HURP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DLGAP5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HURP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HURP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DLGAP5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.