HSP 40 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402810-ACT

DNAJB1 kodiert das menschliche HSP40 (DnaJ-Homolog, Unterfamilie B, Mitglied 1), ein zytosolisches Co-Chaperon, das mit HSP70 zusammenwirkt, um Proteinfaltung, Refaltung und die Sortierung fehlgefalteter Substrate zu regulieren. Durch die Stimulation der ATPase-Aktivität von HSP70 unterstützt HSP40 die Proteostase in verschiedenen Stressantworten, darunter Hitzeschock und oxidativer Stress, und steht in Verbindung mit Signalwegen, die den Ubiquitin-Proteasom-Abbau sowie Autophagie steuern. Die Aktivität von DNAJB1 beeinflusst zelluläre Reaktionen auf proteotoxischen Stress; Studien bringen sie mit Neurodegeneration, viraler Replikation und onkogenen Prozessen in Zusammenhang, bei denen Chaperon-Netzwerke Signalübertragung und Proteinstabilität modulieren. Eine Fehlregulation des Gleichgewichts zwischen Chaperonen und Co-Chaperonen wird häufig im Hinblick auf ihre Auswirkungen auf aggregationsanfällige Proteine und stressadaptive transkriptionelle Programme untersucht.

HSP 40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DNAJB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HSP 40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DNAJB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DNAJB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HSP 40-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DNAJB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HSP 40-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HSP 40-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DNAJB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.